Curva de concentraciones de DNA

Como se mencionó hace ya un buen rato en este blog, hay que preparar diluciones decimales del DNA del organismo que contiene el gen que nos interesa estudiar. Lo ideal es obtenerlo con algún kit comercial, pero los protocolos de cada lab sirven. Algo importante es que hay que asegurarse de que el RNA ha sido completamente degradado. Existen diversos protocolos dependiendo del organismo del que se trata (lo mismo para aislar DNA) y estos deben ser estandarizados en el laboratorio.

Una vez purificado el DNA genómico (DNAg) se debe cuantificar usando un espectrofotómetro a 260 nm y usando la fórmula: 1 DO600= 50 mg/ml

A continuación se preparan diluciones del DNAg para obtener las siguientes concentraciones:
10 ng/ul, 1 ng/ul, 0.1 ng/ul, 0.01 ng/ul y 0.001ng/ul. Estas serán usadas en las reacciones de estandarización en el aparato de qPCR.

Después de descongelar en el hielo los reactivos (mezcla comercial conteniendo SYBR Green, enzima y dNTPs; los dos oligos del gen a estudiar, las diluciones del DNAg y agua grado biol. mol) se procede a preparar las mezclas. Personalmente me gusta más hacer una "mezcla maestra" y, como en este caso, adicionar ya a cada tubo el DNA a la concentración específica.

Algo que considero importante es hacer triplicados cuando se está aprendiendo a hacer esta técnica. ¿Por qué? porque es una técnica muy sensible y se espera que los duplicados o triplicados queden muy cercanos en sus lecturas o, por lo menos, con un error muy bajo (menor al 10%).

Lo siguiente es conocer bien el aparato a usar y las especificaciones del fabricante, esto para saber si requiere de placas o tubos especiales (como los de ABI), películas especiales, alguna calibración o mantenimiento previo, etc.

Para la programación del aparato se deben seguir los mismos ciclos y Tm´s que se usaron en la estandarización del punto final mencionada anteriormente. También, cuando se programa el aparato hay que asegurarse de que las lecturas que realiza sean durante el ciclo de extensión (generalmente a 70 o 72oC). También, y en especial durante la estandarización, que se lleve a cabo un ciclo extra al final de la corrida. Durante este ciclo se programa al aparato para desnaturalizar el DNA y realizar mediciones en cada oC que aumenta. Ya veremos para qué sirve esto.

Saludos