Bueno, después de mucho tiempo sin meter información trataré de continuar con esto.
Hasta donde nos quedamos fue en como ordenar oligonucleótidos para el qPCR y estamos implementando el uso de SYBR Green.
Pues bien, ya se tiene los oligos. Hay que hacer una dilución inicial a 10 uM (10 pmol/ul) de preferencia con agua libre de nucleasas.
El primer paso es verificar que los oligos o "primers" amplifican en una reacción de PCR de punto final usando los parámetros de Tm y de extensión para cada par de oligos. Al correr el o los productos en un gel de agarosa, estos deben ser únicos y de una buena concentración. Si esto no ocurre entonces hay que encontrar las condiciones óptimas de la reacción, ya sea modificando la Tm o bien cambiando la concentración de magnesio, DNA molde, etc.
Ya que se ha pasado este primer punto, hay que realizar la detección de los productos en el termociclador de tiempo real. Lo cual abordaré en la siguiente contribución.
Saludos
