Oligos, continuación

Bueno, siguiendo con la idea ya planteada, hay que diseñar los oligos para el qPCR. Para esto hay que tomar varias consideraciones, tales como:
Si sé realizará SYBR green o bien Taqman. Esto es importante, pues el tamaño del fragmento a amplificar varía. Para el último, generalmente se diseñan oligos para extender aprox. 60 pb y además se requiere de diseñar una sonda que hibridará con la región de DNA del fragmento amplificado. Para el diseño de los oligos y de las sondas se pueden usar programas en la red en los cuales se introduce el segmento a amplificar y el programa los diseñara. Algunos ejemplos de los mismos son:

- IDT
- Roche
- Eurofins MWG

- Y muchas más que se pueden buscar en la red.
Realmente todas funcionan igual, en lo particular la de IDT es mas gráfica al indicar en que parte del gen se han generado tanto oligos como sonda.
Si es con SYBR green, los mismos sitios tienen herramientas para diseñar estos primers también. Ojo, aquí sólo se requieren de un par de oligos y no una sonda. Si hay dudas de por qué, favor de escribir la pregunta.
Los sitios ya mencionados (IDT, etc) su pueden usar también omitiendo la secuencia de la sonda para Taqman.

Ahora bien, todavía hay quienes preferimos hacer las cosas a mano y no confiar en las computadoras. Así las cosas, y siendo de ese arcaico sistema, expondré las reglas que sigo para diseñar oligos para qPCR:
a) Seleccionar una región que no contiene intrones, esto para los que trabajan con eucariotes
b) El oligo debe ser entre 18 a 25 nts
c) No corridas de más de 4 bases idénticas repetidas  (i.e. AAAA o TTTT, etc.)
d) Tratar de mantener, cuando sea posible, un % de GC de entre 40 y 60%)
e) Tratar de tener una base G o C en el extremo 3'
f) El fragmento a generar debe ser de entre 80 a 250 pb, aunque puede ser más grande o un poco más pequeño
g) Una vez diseñados los oligos, verificar que no se forman dímeros y que no hay estructuras secundarias fuertes (revisar la delta G). Para esto se pueden usar las herramientas ya mencionadas de IDT u otro servidor.
h) Verificar que los oligos tienen identidad preferencial con el organismo a estudiar, esto es que no se "cruzan" con otros.

Bueno, hasta aquí hoy. Preguntas? Correcciones? Comentarios? usen la sección de comentarios.