Procedimientos para el qPCR o RT-PCR

Procedimientos para el qPCR o RT-PCR

Bueno, espero que esto vaya funcionando. A continuación empezaré a describir como hacer un diagrama de flujo de está técnica que ahora tiene tanta aceptación. Lo que escribiré es basado en experiencia propia adquirida principalmente en los RML y un poco en USF. Por supuesto, lo escrito y descrito no es "fools proof" y está sujeto a mejorarse. También se aceptan sugerencias, comentarios, preguntas, etc. Iré escribiendo conforme pasen los días y también corrigiendo mis propios escritos. No tengo mucha experiencia en "blogging" pero no se gana más que haciéndolo.

Inicio  
Iniciaré tomando en consideración el uso de RT-PCR para detectar la expresión de genes, para una revisión sencilla pueden ver este link de wikipedia, aunque es mejor buscar una revisión de revista científica.
Así pues, en este protocolo se pretende estudiar la expresión de un gen X en un organismo Z en una condición estándar comparada con un estrés nutritivo.
Aquí hay que tener en consideración incluir en el estudio un gen cuya expresión no cambiará, o se cree que no lo hará, en ambas condiciones. A estos se les ha mal llamado de "housekeeping" o constitutivo, pero en realidad es muy complejo considerar a un gen como constitutivo, pero eso puede dejarse a debate. De los genes más usados en bacterias están el que codifica para el rRNA 16S o el de la subunidad beta de la RNA pol (rpoB) entre otros. En eucariotes se han usado el que codifica para actina o para la G3PDH.
Bueno, ya elegido el gen a estudiar X y el control, pongamos actina, hay que diseñar los oligos para el estudio. Lo cual se vera en el siguiente blog.

Oooops!

El grupo de Google ya funciona! por alguna razón en mi Google Chrome no jalaba pero al intentarlo en Mozilla ya funcionó! Esto por si a ustedes no les ha jalado.

Lo bueno del grupo de Google es que ahi si podemos pegar archivos, así que tratare de complementar ambas plataformas.

Saludos

Jaig

Cuantificación por PCR en tiempo real

Van tres citas pàra iniciar con la cuantificación en PCR en tiempo real. Son las más usadas y utiles. En mi particular experiencia con está técnica he usado la determinación por concentración la llamada delta-delta-Ct.

1. Pfaffl MW, Horgan GW & Dempfle L, 2002. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research 30: 9 e36

2. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, & Moorman AF, 2003. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters 339: 62–6

3. Livak KJ & Schmittgen TD, 2001 Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- CT) method. Methods 25(4): 402–8

Ahora que aprenda a subir archivos anexaré los PDFs pero mientras, si les interesan solicítenlos por correo o bien "bájenlos" usando Pubmed.

Intenciones del blog

Hola,

Este blog ha sido creado con la idea de compartir literatura, protocolos, inquietudes, dar respuesta a las mismas, etc. referentes a preguntas en protocolos de técnicas de biología molecular. Como sabemos, esto último puede ser muy ambiguo, por lo variado que son dichas técnicas. No importa, de igual manera trataremos de proveer información de técnicas como:

- Purificación de DNA (genómico y plasmídico)
- Clonación
- Expresión
- PCR
- Purificación de RNA
- PCR en tiempo real
- Mutagénesis sitio dirigida
- Western blot
- Inmunoprecipitaciones
- Obtención de anticuerpos
- Southern blot
- etc.

Solo por mencionar algunos. También se colocarán artículos de interés e informativos. Listo, la idea es compartir y aprender de todos. Espero sea una buena herramienta y de utilidad a la comunidad.

Saludos

Jaig