Curva de concentraciones de DNA

Como se mencionó hace ya un buen rato en este blog, hay que preparar diluciones decimales del DNA del organismo que contiene el gen que nos interesa estudiar. Lo ideal es obtenerlo con algún kit comercial, pero los protocolos de cada lab sirven. Algo importante es que hay que asegurarse de que el RNA ha sido completamente degradado. Existen diversos protocolos dependiendo del organismo del que se trata (lo mismo para aislar DNA) y estos deben ser estandarizados en el laboratorio.

Una vez purificado el DNA genómico (DNAg) se debe cuantificar usando un espectrofotómetro a 260 nm y usando la fórmula: 1 DO600= 50 mg/ml

A continuación se preparan diluciones del DNAg para obtener las siguientes concentraciones:
10 ng/ul, 1 ng/ul, 0.1 ng/ul, 0.01 ng/ul y 0.001ng/ul. Estas serán usadas en las reacciones de estandarización en el aparato de qPCR.

Después de descongelar en el hielo los reactivos (mezcla comercial conteniendo SYBR Green, enzima y dNTPs; los dos oligos del gen a estudiar, las diluciones del DNAg y agua grado biol. mol) se procede a preparar las mezclas. Personalmente me gusta más hacer una "mezcla maestra" y, como en este caso, adicionar ya a cada tubo el DNA a la concentración específica.

Algo que considero importante es hacer triplicados cuando se está aprendiendo a hacer esta técnica. ¿Por qué? porque es una técnica muy sensible y se espera que los duplicados o triplicados queden muy cercanos en sus lecturas o, por lo menos, con un error muy bajo (menor al 10%).

Lo siguiente es conocer bien el aparato a usar y las especificaciones del fabricante, esto para saber si requiere de placas o tubos especiales (como los de ABI), películas especiales, alguna calibración o mantenimiento previo, etc.

Para la programación del aparato se deben seguir los mismos ciclos y Tm´s que se usaron en la estandarización del punto final mencionada anteriormente. También, cuando se programa el aparato hay que asegurarse de que las lecturas que realiza sean durante el ciclo de extensión (generalmente a 70 o 72oC). También, y en especial durante la estandarización, que se lleve a cabo un ciclo extra al final de la corrida. Durante este ciclo se programa al aparato para desnaturalizar el DNA y realizar mediciones en cada oC que aumenta. Ya veremos para qué sirve esto.

Saludos

Escribiendo "papers"

Mientras, y con el fin de mantener esto vivo, les sugiero revisar la siguiente liga sobre como escribir artículos científicos. Nada que ver con qPCRs pero muy útil para aquellos que y tenemos que escribir y revisar textos reportando investigación. En este texto el Dr. Borja aborda los distintos aspectos de la escritura y revisión de artículos.

http://www.elsevier.com/connect/writing-a-science-paper-some-dos-and-donts?sf8195043=1

Saludos y espero sea de utilidad.

Volúmenes a utilizar en reacciones de qPCR

Lento, esto va lento...
Actividades varias y procrastinación han mantenido esto muy atrasado. En fin, trataré de continuar.

Cabe mencionar que, aunque logremos observar un solo producto en el gel de agarosa después de hacer un PCR de punto final con los oligos diseñados, eso no es garantía de que estos oligos funcionarán en el qPCR.

Continuamos con la idea de usar el SYBR green para estas cuantificaciones, pero esta estandarización se debe hacer también cuando se usa otro tipo de moléculas reporteras. Actualmente hay muchas variantes de reactivos que contienen SYBR green, tantas como casas comerciales existen. Hasta donde sé, y puedo equivocarme, el estándar de oro es el reactivo de Applied Biosystems. Sin embargo, el mismo es muy caro y existen alternativas más económicas. Lo conveniente es pedir kits de prueba para determinar si un determinado reactivo nos será útil o no. Claro, este debe probarse con una reacción que sabemos funciona.

En general, los reactivos que actualmente se venden son "mezclas maestras" al 2X. Esto es, que contienen todos los reactivos necesarios para usarse inmediatamente y solo se requiere adicionar los oligos, el DNA y agua.

¿Qué volumen usar? Aunque en general los fabricantes recomiendan usar reacciones de 50 ul, se pueden usar volumenes más pequeños y así ahorrar el reactivo. Por supuesto que esto dependerá del aparato que se empleará. En el laboratorio hemos disminuido el volumen hasta 10 ul, con lo cual tenemos más reacciones por frasco de reactivo 2X usando los aparatos de Qiagen y de Applied Biosystems.

Ya con el reactivo, el aparato de PCR en tiempo real y los oligos hay que hacer una curva de concentración de DNA.

Será lo siguiente, espero que no dentro de mucho!!

Preguntas? comentarios? adelante!

Preparación de los oligos

Bueno, después de mucho tiempo sin meter información trataré de continuar con esto.

Hasta donde nos quedamos fue en como ordenar oligonucleótidos para el qPCR y estamos implementando el uso de SYBR Green.

Pues bien, ya se tiene los oligos. Hay que hacer una dilución inicial a 10 uM (10 pmol/ul) de preferencia con agua libre de nucleasas.

El primer paso es verificar que los oligos o "primers" amplifican en una reacción de PCR de punto final usando los parámetros de Tm y de extensión para cada par de oligos. Al correr el o los productos en un gel de agarosa, estos deben ser únicos y de una buena concentración. Si esto no ocurre entonces hay que encontrar las condiciones óptimas de la reacción, ya sea modificando la Tm o bien cambiando la concentración de magnesio, DNA molde, etc.

Ya que se ha pasado este primer punto, hay que realizar la detección de los productos en el termociclador de tiempo real. Lo cual abordaré en la siguiente contribución.

Saludos

Oligos, continuación

Bueno, siguiendo con la idea ya planteada, hay que diseñar los oligos para el qPCR. Para esto hay que tomar varias consideraciones, tales como:
Si sé realizará SYBR green o bien Taqman. Esto es importante, pues el tamaño del fragmento a amplificar varía. Para el último, generalmente se diseñan oligos para extender aprox. 60 pb y además se requiere de diseñar una sonda que hibridará con la región de DNA del fragmento amplificado. Para el diseño de los oligos y de las sondas se pueden usar programas en la red en los cuales se introduce el segmento a amplificar y el programa los diseñara. Algunos ejemplos de los mismos son:

- IDT
- Roche
- Eurofins MWG

- Y muchas más que se pueden buscar en la red.
Realmente todas funcionan igual, en lo particular la de IDT es mas gráfica al indicar en que parte del gen se han generado tanto oligos como sonda.
Si es con SYBR green, los mismos sitios tienen herramientas para diseñar estos primers también. Ojo, aquí sólo se requieren de un par de oligos y no una sonda. Si hay dudas de por qué, favor de escribir la pregunta.
Los sitios ya mencionados (IDT, etc) su pueden usar también omitiendo la secuencia de la sonda para Taqman.

Ahora bien, todavía hay quienes preferimos hacer las cosas a mano y no confiar en las computadoras. Así las cosas, y siendo de ese arcaico sistema, expondré las reglas que sigo para diseñar oligos para qPCR:
a) Seleccionar una región que no contiene intrones, esto para los que trabajan con eucariotes
b) El oligo debe ser entre 18 a 25 nts
c) No corridas de más de 4 bases idénticas repetidas  (i.e. AAAA o TTTT, etc.)
d) Tratar de mantener, cuando sea posible, un % de GC de entre 40 y 60%)
e) Tratar de tener una base G o C en el extremo 3'
f) El fragmento a generar debe ser de entre 80 a 250 pb, aunque puede ser más grande o un poco más pequeño
g) Una vez diseñados los oligos, verificar que no se forman dímeros y que no hay estructuras secundarias fuertes (revisar la delta G). Para esto se pueden usar las herramientas ya mencionadas de IDT u otro servidor.
h) Verificar que los oligos tienen identidad preferencial con el organismo a estudiar, esto es que no se "cruzan" con otros.

Bueno, hasta aquí hoy. Preguntas? Correcciones? Comentarios? usen la sección de comentarios.

Procedimientos para el qPCR o RT-PCR

Procedimientos para el qPCR o RT-PCR

Bueno, espero que esto vaya funcionando. A continuación empezaré a describir como hacer un diagrama de flujo de está técnica que ahora tiene tanta aceptación. Lo que escribiré es basado en experiencia propia adquirida principalmente en los RML y un poco en USF. Por supuesto, lo escrito y descrito no es "fools proof" y está sujeto a mejorarse. También se aceptan sugerencias, comentarios, preguntas, etc. Iré escribiendo conforme pasen los días y también corrigiendo mis propios escritos. No tengo mucha experiencia en "blogging" pero no se gana más que haciéndolo.

Inicio  
Iniciaré tomando en consideración el uso de RT-PCR para detectar la expresión de genes, para una revisión sencilla pueden ver este link de wikipedia, aunque es mejor buscar una revisión de revista científica.
Así pues, en este protocolo se pretende estudiar la expresión de un gen X en un organismo Z en una condición estándar comparada con un estrés nutritivo.
Aquí hay que tener en consideración incluir en el estudio un gen cuya expresión no cambiará, o se cree que no lo hará, en ambas condiciones. A estos se les ha mal llamado de "housekeeping" o constitutivo, pero en realidad es muy complejo considerar a un gen como constitutivo, pero eso puede dejarse a debate. De los genes más usados en bacterias están el que codifica para el rRNA 16S o el de la subunidad beta de la RNA pol (rpoB) entre otros. En eucariotes se han usado el que codifica para actina o para la G3PDH.
Bueno, ya elegido el gen a estudiar X y el control, pongamos actina, hay que diseñar los oligos para el estudio. Lo cual se vera en el siguiente blog.

Oooops!

El grupo de Google ya funciona! por alguna razón en mi Google Chrome no jalaba pero al intentarlo en Mozilla ya funcionó! Esto por si a ustedes no les ha jalado.

Lo bueno del grupo de Google es que ahi si podemos pegar archivos, así que tratare de complementar ambas plataformas.

Saludos

Jaig