Bueno, después de mucho tiempo sin meter información trataré de continuar con esto.
Hasta donde nos quedamos fue en como ordenar oligonucleótidos para el qPCR y estamos implementando el uso de SYBR Green.
Pues bien, ya se tiene los oligos. Hay que hacer una dilución inicial a 10 uM (10 pmol/ul) de preferencia con agua libre de nucleasas.
El primer paso es verificar que los oligos o "primers" amplifican en una reacción de PCR de punto final usando los parámetros de Tm y de extensión para cada par de oligos. Al correr el o los productos en un gel de agarosa, estos deben ser únicos y de una buena concentración. Si esto no ocurre entonces hay que encontrar las condiciones óptimas de la reacción, ya sea modificando la Tm o bien cambiando la concentración de magnesio, DNA molde, etc.
Ya que se ha pasado este primer punto, hay que realizar la detección de los productos en el termociclador de tiempo real. Lo cual abordaré en la siguiente contribución.
Saludos
lunes, 7 de octubre de 2013
lunes, 1 de julio de 2013
Oligos, continuación
Bueno, siguiendo con la idea ya planteada, hay que diseñar los oligos para el qPCR. Para esto hay que tomar varias consideraciones, tales como:
Si sé realizará SYBR green o bien Taqman. Esto es importante, pues el tamaño del fragmento a amplificar varía. Para el último, generalmente se diseñan oligos para extender aprox. 60 pb y además se requiere de diseñar una sonda que hibridará con la región de DNA del fragmento amplificado. Para el diseño de los oligos y de las sondas se pueden usar programas en la red en los cuales se introduce el segmento a amplificar y el programa los diseñara. Algunos ejemplos de los mismos son:
- IDT
- Roche
- Eurofins MWG
- Y muchas más que se pueden buscar en la red.
Realmente todas funcionan igual, en lo particular la de IDT es mas gráfica al indicar en que parte del gen se han generado tanto oligos como sonda.
Si es con SYBR green, los mismos sitios tienen herramientas para diseñar estos primers también. Ojo, aquí sólo se requieren de un par de oligos y no una sonda. Si hay dudas de por qué, favor de escribir la pregunta.
Los sitios ya mencionados (IDT, etc) su pueden usar también omitiendo la secuencia de la sonda para Taqman.
Ahora bien, todavía hay quienes preferimos hacer las cosas a mano y no confiar en las computadoras. Así las cosas, y siendo de ese arcaico sistema, expondré las reglas que sigo para diseñar oligos para qPCR:
a) Seleccionar una región que no contiene intrones, esto para los que trabajan con eucariotes
b) El oligo debe ser entre 18 a 25 nts
c) No corridas de más de 4 bases idénticas repetidas (i.e. AAAA o TTTT, etc.)
d) Tratar de mantener, cuando sea posible, un % de GC de entre 40 y 60%)
e) Tratar de tener una base G o C en el extremo 3'
f) El fragmento a generar debe ser de entre 80 a 250 pb, aunque puede ser más grande o un poco más pequeño
g) Una vez diseñados los oligos, verificar que no se forman dímeros y que no hay estructuras secundarias fuertes (revisar la delta G). Para esto se pueden usar las herramientas ya mencionadas de IDT u otro servidor.
h) Verificar que los oligos tienen identidad preferencial con el organismo a estudiar, esto es que no se "cruzan" con otros.
Bueno, hasta aquí hoy. Preguntas? Correcciones? Comentarios? usen la sección de comentarios.
domingo, 30 de junio de 2013
Procedimientos para el qPCR o RT-PCR
Procedimientos para el qPCR o RT-PCR
Bueno, espero que esto vaya funcionando. A continuación empezaré a describir como hacer un diagrama de flujo de está técnica que ahora tiene tanta aceptación. Lo que escribiré es basado en experiencia propia adquirida principalmente en los RML y un poco en USF. Por supuesto, lo escrito y descrito no es "fools proof" y está sujeto a mejorarse. También se aceptan sugerencias, comentarios, preguntas, etc. Iré escribiendo conforme pasen los días y también corrigiendo mis propios escritos. No tengo mucha experiencia en "blogging" pero no se gana más que haciéndolo.
Inicio
Iniciaré tomando en consideración el uso de RT-PCR para detectar la expresión de genes, para una revisión sencilla pueden ver este link de wikipedia, aunque es mejor buscar una revisión de revista científica.
Así pues, en este protocolo se pretende estudiar la expresión de un gen X en un organismo Z en una condición estándar comparada con un estrés nutritivo.
Aquí hay que tener en consideración incluir en el estudio un gen cuya expresión no cambiará, o se cree que no lo hará, en ambas condiciones. A estos se les ha mal llamado de "housekeeping" o constitutivo, pero en realidad es muy complejo considerar a un gen como constitutivo, pero eso puede dejarse a debate. De los genes más usados en bacterias están el que codifica para el rRNA 16S o el de la subunidad beta de la RNA pol (rpoB) entre otros. En eucariotes se han usado el que codifica para actina o para la G3PDH.
Bueno, ya elegido el gen a estudiar X y el control, pongamos actina, hay que diseñar los oligos para el estudio. Lo cual se vera en el siguiente blog.
Bueno, espero que esto vaya funcionando. A continuación empezaré a describir como hacer un diagrama de flujo de está técnica que ahora tiene tanta aceptación. Lo que escribiré es basado en experiencia propia adquirida principalmente en los RML y un poco en USF. Por supuesto, lo escrito y descrito no es "fools proof" y está sujeto a mejorarse. También se aceptan sugerencias, comentarios, preguntas, etc. Iré escribiendo conforme pasen los días y también corrigiendo mis propios escritos. No tengo mucha experiencia en "blogging" pero no se gana más que haciéndolo.
Inicio
Iniciaré tomando en consideración el uso de RT-PCR para detectar la expresión de genes, para una revisión sencilla pueden ver este link de wikipedia, aunque es mejor buscar una revisión de revista científica.
Así pues, en este protocolo se pretende estudiar la expresión de un gen X en un organismo Z en una condición estándar comparada con un estrés nutritivo.
Aquí hay que tener en consideración incluir en el estudio un gen cuya expresión no cambiará, o se cree que no lo hará, en ambas condiciones. A estos se les ha mal llamado de "housekeeping" o constitutivo, pero en realidad es muy complejo considerar a un gen como constitutivo, pero eso puede dejarse a debate. De los genes más usados en bacterias están el que codifica para el rRNA 16S o el de la subunidad beta de la RNA pol (rpoB) entre otros. En eucariotes se han usado el que codifica para actina o para la G3PDH.
Bueno, ya elegido el gen a estudiar X y el control, pongamos actina, hay que diseñar los oligos para el estudio. Lo cual se vera en el siguiente blog.
martes, 25 de junio de 2013
Oooops!
El grupo de Google ya funciona! por alguna razón en mi Google Chrome no jalaba pero al intentarlo en Mozilla ya funcionó! Esto por si a ustedes no les ha jalado.
Lo bueno del grupo de Google es que ahi si podemos pegar archivos, así que tratare de complementar ambas plataformas.
Saludos
Jaig
Lo bueno del grupo de Google es que ahi si podemos pegar archivos, así que tratare de complementar ambas plataformas.
Saludos
Jaig
lunes, 24 de junio de 2013
Cuantificación por PCR en tiempo real
Van tres citas pàra iniciar con la cuantificación en PCR en tiempo real. Son las más usadas y utiles. En mi particular experiencia con está técnica he usado la determinación por concentración la llamada delta-delta-Ct.
1. Pfaffl MW, Horgan GW & Dempfle L, 2002. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research 30: 9 e36
2. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, & Moorman AF, 2003. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters 339: 62–6
3. Livak KJ & Schmittgen TD, 2001 Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- CT) method. Methods 25(4): 402–8
Ahora que aprenda a subir archivos anexaré los PDFs pero mientras, si les interesan solicítenlos por correo o bien "bájenlos" usando Pubmed.
1. Pfaffl MW, Horgan GW & Dempfle L, 2002. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research 30: 9 e36
2. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, & Moorman AF, 2003. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters 339: 62–6
3. Livak KJ & Schmittgen TD, 2001 Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- CT) method. Methods 25(4): 402–8
Ahora que aprenda a subir archivos anexaré los PDFs pero mientras, si les interesan solicítenlos por correo o bien "bájenlos" usando Pubmed.
Intenciones del blog
Hola,
Este blog ha sido creado con la idea de compartir literatura, protocolos, inquietudes, dar respuesta a las mismas, etc. referentes a preguntas en protocolos de técnicas de biología molecular. Como sabemos, esto último puede ser muy ambiguo, por lo variado que son dichas técnicas. No importa, de igual manera trataremos de proveer información de técnicas como:
- Purificación de DNA (genómico y plasmídico)
- Clonación
- Expresión
- PCR
- Purificación de RNA
- PCR en tiempo real
- Mutagénesis sitio dirigida
- Western blot
- Inmunoprecipitaciones
- Obtención de anticuerpos
- Southern blot
- etc.
Solo por mencionar algunos. También se colocarán artículos de interés e informativos. Listo, la idea es compartir y aprender de todos. Espero sea una buena herramienta y de utilidad a la comunidad.
Saludos
Jaig
Este blog ha sido creado con la idea de compartir literatura, protocolos, inquietudes, dar respuesta a las mismas, etc. referentes a preguntas en protocolos de técnicas de biología molecular. Como sabemos, esto último puede ser muy ambiguo, por lo variado que son dichas técnicas. No importa, de igual manera trataremos de proveer información de técnicas como:
- Purificación de DNA (genómico y plasmídico)
- Clonación
- Expresión
- PCR
- Purificación de RNA
- PCR en tiempo real
- Mutagénesis sitio dirigida
- Western blot
- Inmunoprecipitaciones
- Obtención de anticuerpos
- Southern blot
- etc.
Solo por mencionar algunos. También se colocarán artículos de interés e informativos. Listo, la idea es compartir y aprender de todos. Espero sea una buena herramienta y de utilidad a la comunidad.
Saludos
Jaig
